大量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明書

大量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明書
 
 
MaxiGel Extraction Kit
貨號：  K0518
保   存：  室溫
組分說明
Cat.No.                         K0518
KitSize                          50
BufferPG                       100ml
BufferPS                        15ml
BufferPW（concentrate）          10ml
BufferEB                        10ml
SpinColumnDL                  50
CollectionTube（2ml）          50
產(chǎn)品簡介
     本試劑盒采用新型硅基質(zhì)膜技術(shù)，通過快速，簡單的結(jié)合-洗滌-洗脫步驟可從大量普通或低熔點瓊脂糖凝膠中回收純
化 50bp-50kb 的 DNA 片段，溶膠速度快，每個吸附柱最高可吸附 30 μg 的 DNA，純化過程中有效去除引物、核苷酸、
酶、礦物油、瓊脂糖等雜質(zhì)，獲得高純度，完整性好的 DNA 片段，回收率高達 90%。本試劑盒回收純化的 DNA 可直接用
于測序、連接和轉(zhuǎn)化、酶切、標(biāo)記、體外轉(zhuǎn)錄等分子生物學(xué)實驗。
注意事項
1..第一次使用前應(yīng)按照試劑瓶標(biāo)簽的說明在BufferPW中加入無水乙醇。
2.使用前請檢查BufferPG是否出現(xiàn)結(jié)晶或者沉淀，如有結(jié)晶或者沉淀現(xiàn)象，可在37℃水浴幾分鐘，即可恢復(fù)澄清。
3.電泳時最好使用新的電泳緩沖液，以免影響電泳和回收效果。
4.切膠時，紫外照射時間應(yīng)盡量短，以免對DNA造成損傷。
5.回收率與初始 DNA 量和洗脫體積有關(guān)。
6.所有離心步驟均為使用常規(guī)臺式離心機室溫下進行離心。
自備：無水乙醇，離心管
 
操作步驟
 
1. 將單一目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下（盡量切除多余部分），放入干凈的離心管（自備）中，稱取重量。 
注意：若膠塊的體積過大，可將膠塊切成碎塊。
2. 向膠塊中加入3倍體積Buffer PG；當(dāng)瓊脂糖凝膠濃度>2%時，建議使用6倍體積BufferPG（如凝膠重為100mg，其體積可視為100μl，依此類推）。
3. 50℃孵育10分鐘，其間不斷溫和地上下顛倒離心管，以確保膠塊充分溶解。如果還有未溶的膠塊，可再補加一些溶膠液或繼續(xù)放置幾分鐘，直至膠塊完全溶解。
注意：1）在膠充分溶解后檢測pH值，若pH值大于7.5，可向含有DNA的膠溶液中加10-30μl 的3M醋酸鈉（pH5.0）將pH值調(diào)到5-7。
      2）膠塊完全溶解后最好將膠溶液溫度降至室溫再上柱，因為吸附柱在較高溫度時結(jié)合 DNA 的能力較弱。
4.（可選步驟）當(dāng)回收片段<500bp或>4kb時，應(yīng)加入1倍膠體積的異丙醇，上下顛倒混勻（如凝膠為100mg，則加入100μl異丙醇）。
注意：當(dāng)回收片段為500bp-4kb時，加入異丙醇不會影響回收率。
5.柱平衡：向已裝入收集管（CollectionTube）中的吸附柱（SpinColumnDL）中加入200  μl Buffer PS，12,000rpm（~13,400×g）離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
6.將步驟3或者步驟4所得溶液加入到已裝入收集管的吸附柱中，室溫放置2分鐘，12,000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中。
注意：吸附柱容積為700μl，若樣品體積大于700μl 可分批加入。
7.（可選步驟）向吸附柱中加入500μlBufferPG，12,000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中。
注意：如果后續(xù)實驗用于直接測序、體外轉(zhuǎn)錄或顯微注射，推薦用此步驟以除去所有凝膠。
8. 向吸附柱中加入650 μl Buffer PW（使用前請先檢查是否已加入無水乙醇），12,000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中。
9. 注意：如果純化的DNA用于鹽敏感的實驗（例如平末端連接或直接測序），建議加入BufferPW靜置2-5分鐘再離心。12,000rpm離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液。將吸附柱置于室溫數(shù)分鐘，以徹底晾干。
注意：這一步的目的是將吸附柱中殘余的乙醇去除，乙醇的殘留會影響后續(xù)的酶促反應(yīng)（酶切、PCR等）。為確保下游實驗不受殘留乙醇的影響，建議將吸附柱開蓋，置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的乙醇。
10.  將吸附柱放到一個新離心管（自備）中，向吸附膜中間位置懸空滴加100 μl Buffer EB（pH 8.5），室溫放置2分鐘。12,000rpm離心2分鐘，收集DNA溶液。-20℃保存DNA。注意：1） 洗脫液的pH值對于洗脫效率有很大影響。若用水做洗脫液，應(yīng)保證其pH值在7.0-8.5（可以用NaOH將水的pH值調(diào)到此范圍）。
2） 為了提高DNA的回收量，可將離心得到的溶液重新滴加到吸附柱中，重復(fù)步驟10。
3） 洗脫體積不應(yīng)小于50μl，體積過少會影響回收效率。
4） 如果使用TE洗脫，需要考慮其中含有的EDTA是否會影響后續(xù)的酶促反應(yīng)。
5）回收大于10kb的DNA片段時，BufferEB應(yīng)在50℃水浴中預(yù)熱，適當(dāng)延長吸附和洗脫時間，可增加回收效率。
 
 
 
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